草蝦是我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中的一種重要經濟物種，但近年來，寄生于其肝胰腺的肝腸胞蟲嚴重影響了其養(yǎng)殖產業(yè)。由于目前沒有有效的藥物或疫苗可以治療該病，快速而精準的檢測對于防止病害傳播至關重要。

EHP孢子掃描電鏡觀察結果A.放大9.0×10³倍; B.放大5.0×10⁴倍.

喬毅, 沈輝, 萬夕和, 范賢平, 蔣葛, 黎慧, 王李寶, 史文軍, 成婕. 南美白對蝦肝腸胞蟲的分離及形態(tài)學觀察. 中國水產科學, 2018, 25(5): 1051-1058. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17430.

肝腸胞蟲的檢測主要依賴于分子生物學方法，其中最常見的是PCR技術。然而，PCR技術雖然靈敏度高，但需要昂貴的PCR儀器和專業(yè)的實驗室環(huán)境，且操作復雜，不適合現(xiàn)場使用。為了解決這一問題，研究團隊開發(fā)了兩種基于MIRA技術的快速檢測方法，這些方法具有高靈敏度、快速反應和易操作的特點，能夠在現(xiàn)場不需要復雜實驗設備的情況下，對蝦體中的肝腸胞蟲進行高效、快速的檢測，填補了現(xiàn)有檢測方法不足的空缺。

文章所用的擴增試劑：DNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型）與DNA 恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）

MIRA技術是一種多酶恒溫快速核酸擴增技術。其核心原理是通過多種功能蛋白在常溫下協(xié)同作用，實現(xiàn)核酸的快速擴增，是能夠真正實現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場快速核酸檢測的技術。

研究方法

樣本提取

研究團隊從遼寧省的三個蝦養(yǎng)殖場收集了感染和健康的草蝦樣本，并提取了草蝦的肝胰腺DNA。

引物設計

針對肝腸胞蟲的S8絲氨酸蛋白基因（基因庫登錄號：ON 182063），設計了三對MIRA引物。該基因具有獨特的活性位點，能夠保證檢測的特異性。

MIRA-AGE與MIRA-LFD檢測

(A) 優(yōu)化RPA-AGE反應溫度。M：DL 500標記物；N：陰性對照；分別為品系1-5：25°C、30°C、37°C、39°C和42°C。

(B) 優(yōu)化RPA-AGE反應時間。M：DL 500標記物；N：陰性對照；1：10 min；2：20 min；3： 30 min；4： 40 min。

(C) 優(yōu)化RPA-LFD反應溫度。N：陰性對照；1：25°C；2：30°C；3：37°C；4：39°C；5：42°C。

(D) 優(yōu)化RPA-LFD反應時間。N：陰性對照；1：5 min；2：10 min；3：20 min。

兩種MIRA檢測方法分別通過瓊脂糖凝膠電泳（MIRA-AGE）和膠體金側流免疫層析法（MIRA-LFD）實現(xiàn)檢測。研究團隊通過實驗優(yōu)化了反應溫度和時間。MIRA-AGE在37°C下進行30分鐘擴增，而MIRA-LFD則在37°C下僅需10分鐘即可完成擴增，5分鐘內即可讀取結果。

實驗結果

特異性與靈敏度

(A) RPA-AGE檢測的特異性。M：DL 1000標記物；P：蒿型腸孢菌；1：肝減少腸細胞；2：肝孢菌；3：微孢子蟲；4：白斑綜合征病毒；6：異常威克漢姆酵母；N：陰性對照。

(B) RPA-LFD檢測的特異性。P：蒿型腸孢菌；N：陰性對照；1：肝減少腸細胞；2：肝孢菌；3：微孢子蟲；4：白斑綜合征病毒；6：異常威克漢姆酵母。

(C) RPA-AGE對重組質粒梯度稀釋的敏感性。M： DL 500標記；N：陰性對照；1： 4.7×10^5拷貝/µL；2： 4.7×10^4拷貝/µL；3： 4.7×10^3拷貝/µL；4： 4.7×10^2拷貝/µL；5： 4.7×10拷貝/µL；6： 4.7拷貝/µL。

(D)  RPA-LFD對重組質粒梯度稀釋的敏感性。N：陰性對照；1： 4.7×10^5拷貝/µL；2： 4.7×10^4拷貝/µL；3： 4.7×10^3拷貝/µL；4： 4.7×10^2拷貝/µL；5： 4.7×10拷貝/µL；和6： 4.7拷貝/µL。

實驗顯示，MIRA技術具有高度特異性，能夠準確檢測出肝腸胞蟲，而對其他病原體無反應。靈敏度方面，兩種方法的檢測下限均為4.7copies/µL，顯著高于傳統(tǒng)PCR檢測的靈敏度。

臨床樣本檢測

對30個臨床樣本的檢測結果顯示，MIRA-AGE與MIRA-LFD的陽性率均為70%，略低于qPCR80%的陽性率，但遠高于傳統(tǒng)PCR的56.7%的陽性率。

應用前景

基于MIRA的檢測方法能夠在恒溫下快速擴增目標基因，特別是MIRA-LFD方法在短短10分鐘內即可得到結果，無需復雜的實驗設備，非常適合在養(yǎng)殖場等現(xiàn)場環(huán)境中使用。該技術的高靈敏度和高特異性使其成為一種高效的現(xiàn)場檢測工具，有助于養(yǎng)殖者在早期發(fā)現(xiàn)和控制肝腸胞蟲的傳播，從而保護草蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。