近年來，基于CRISPR的核酸檢測(cè)方法，因其較高的特異性和靈敏度，也已被應(yīng)用于感染類診斷方法的開發(fā)。CRISPR診斷方法crRNA準(zhǔn)確識(shí)別核酸靶標(biāo)序列，并激活CRISPR蛋白剪切報(bào)告分子，從而釋放出信號(hào)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的檢測(cè)。然而，由于缺乏合適技術(shù)的引入和集成，現(xiàn)有大多數(shù)CRISPR診斷平臺(tái)仍只能檢測(cè)少數(shù)核酸靶標(biāo)分子，那么結(jié)合恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)又會(huì)碰撞出怎樣的火花？

MIRA與Cas12a檢測(cè)體系原理：

目的基因經(jīng)過恒溫?cái)U(kuò)增富集，Cas12-crRNA復(fù)合體識(shí)別目的基因，激活Cas蛋白的切割活性，從而切割報(bào)告探針，釋放熒光型號(hào)，結(jié)果讀取可以為熒光曲線、藍(lán)光燈下肉眼觀察；膠體金探針被切割，就可以通過試紙條顯色方式結(jié)果判定。

MIRA結(jié)合Cas13a檢測(cè)原理：

通過恒溫?cái)U(kuò)增來富集目的基因產(chǎn)物，與Cas12前端擴(kuò)增區(qū)別點(diǎn)在于，Cas13a前端的恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物有T7啟動(dòng)子序列，經(jīng)過T7轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA，此單鏈RNA被Cas13-crRNA復(fù)合體識(shí)別，Cas13的切割活性被激活，切割報(bào)告探針。結(jié)果呈現(xiàn)和Cas12一樣有熒光型、肉眼判讀、膠體金型等。

不管是Cas12或Cas13的檢測(cè)都離不開前端核酸的擴(kuò)增，因此前端的MIRA基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增至關(guān)重要，同時(shí)前端核酸擴(kuò)增的靈敏度決定后端Cas蛋白檢測(cè)的靈敏度。

MIRA+cas12a的體系配制

MIRA擴(kuò)增體系，包括：緩沖buffer、上下游引物、模板、啟動(dòng)buffer、水補(bǔ)充到50ul體系

Cas12a切割體系包括：緩沖Buffer、Cas12a蛋白、恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物、crRNA等

注意：MIRA恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物是不需要任何處理直接加入到cas蛋白切割體系的。

MIRA+cas13a體系配制

MIRA基礎(chǔ)擴(kuò)增體系，包括：緩沖buffer、上下游引物、模板、啟動(dòng)buffer、水補(bǔ)充到50ul體系

Cas13a體系，包括：cas13a蛋白、恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物、crRNA、報(bào)告探針、RNA酶抑制劑、轉(zhuǎn)錄所需緩沖buffer、T7轉(zhuǎn)錄酶、A/C/G/U轉(zhuǎn)錄所需輔料等，

再次強(qiáng)調(diào)：同樣，MIRA擴(kuò)增產(chǎn)物也不需要任何處理可直接加入到Cas13a切割體系的。

兩種切割體系對(duì)比：

    cas12a需要有TTTV的PAM區(qū)，cas13a不需要；

    cas12a蛋白被雙鏈DNA激活切割活性，Cas13a被單鏈RNA激活切割活性；

    cas12a切割單鏈DNA，因此報(bào)告探針設(shè)計(jì)為單鏈DNA；

  同樣cas13a切割單鏈RNA，報(bào)告探針設(shè)計(jì)為單鏈RNA；

前端MIRA擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)區(qū)別在于Cas13a需要在上引物加上T7啟動(dòng)子序列；最終的試紙條檢測(cè)所用試紙條均為CRISPR專用試紙條，而非普通核酸檢測(cè)試紙條。

MIRA結(jié)合CRISPR檢測(cè)應(yīng)用場(chǎng)景多樣化，由于不受溫度條件、設(shè)備限制及環(huán)境條件的約束，可應(yīng)用到社區(qū)醫(yī)院、社區(qū)監(jiān)測(cè)站、海關(guān)檢疫、家用自測(cè)等多方面。

武漢大學(xué)殷浩老師課題組發(fā)表的，建立了MIRA結(jié)合cas12一管法檢測(cè)平臺(tái)。本文章為提高一管法靈敏度及檢測(cè)時(shí)間使用次優(yōu)PAM區(qū)做了一系列的驗(yàn)證。

推測(cè)一：在一管法反應(yīng)中，CRISPR檢測(cè)即Cas蛋白切割與恒溫?cái)U(kuò)增可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)PAM與cas蛋白結(jié)合力強(qiáng)，使這種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系偏向于cas蛋白切割，導(dǎo)致恒溫?cái)U(kuò)增底物缺乏而延遲或停止擴(kuò)增，最終導(dǎo)致信號(hào)延遲、靈敏度下降。

 為驗(yàn)證以上推測(cè)，作者對(duì)次優(yōu)PAM進(jìn)行探究；首先標(biāo)準(zhǔn)PAM的第一個(gè)核苷酸如果換成其他會(huì)是什么樣的結(jié)果呢？

 作者以新冠Orf基因?yàn)槔�，�?duì)第一個(gè)核苷酸變更的次優(yōu)PAM進(jìn)行了兩步法、一步法數(shù)據(jù)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩步法時(shí)標(biāo)準(zhǔn)PAM優(yōu)于次優(yōu)PAM，一步法時(shí)次優(yōu)PAM檢測(cè)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)PAM。說明標(biāo)準(zhǔn)PAM第一個(gè)核苷酸變更對(duì)一管法是有檢測(cè)意義的。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PAM的第二個(gè)核苷酸也進(jìn)行了變更驗(yàn)證，將T變更為A/G/C，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第二個(gè)堿基為C時(shí)一管法反應(yīng)效果更好。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PAM第3/4個(gè)核苷酸變更也做了一系列驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)也是有一定規(guī)律，具體結(jié)果可以看殷浩老師的文章。

以上驗(yàn)證均以新冠的ORF基因、E基因、N基因?yàn)闄z測(cè)基因得出的數(shù)據(jù)，僅為RNA型核酸檢測(cè)是否能說明這一規(guī)律呢？

作者進(jìn)行了DNA型核酸檢測(cè)此處選用HPV18，對(duì)這一規(guī)律進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)是適用的,具體結(jié)果見文章詳情。

經(jīng)過大量的測(cè)試最終得出結(jié)論，80%以上的次優(yōu)PAM會(huì)在一管法反應(yīng)中熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間縮短。得出最優(yōu)次優(yōu)PAM為VTTV,第二次優(yōu)為TCTV。

接下來作者進(jìn)行了一些靈敏度的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)PAM相比，次優(yōu)PAM靈敏度也能提高10-100倍。

作者用實(shí)際樣本人巨細(xì)胞病毒也做了靈敏度測(cè)試，同時(shí)與QPCR進(jìn)行靈敏度對(duì)比，靈敏度優(yōu)于Qpcr10倍。

熒光曲線檢測(cè)靈敏度高是否同樣肉眼可觀察呢，作者進(jìn)行了應(yīng)用拓展，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)15-20分鐘肉眼判讀靈敏度為24cp/反應(yīng)，與Qpcr的靈敏度是一致的。

同時(shí)也做了膠體金試紙條檢測(cè)，靈敏度與熒光相比，略差。

作者前端做的所有的實(shí)驗(yàn)都是用MIRA試劑盒進(jìn)行的，他們也考慮到此方法是否適用其他的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒呢，就做了安普未來試劑盒與TwistDx試劑盒對(duì)比:

  前端基礎(chǔ)擴(kuò)增靈敏度測(cè)試幾乎無差異，但安普未來試劑盒電泳數(shù)據(jù)條帶更清晰明亮；

  又進(jìn)行了恒溫?cái)U(kuò)增+Cas12a一管法檢測(cè)，結(jié)果我們的試劑盒在靈敏度和熒光檢測(cè)強(qiáng)度方面均優(yōu)于TwistDx試劑盒。

  最終得出結(jié)論：MIRA試劑與Cas12a緩沖環(huán)境兼容性更好。

建立的sPAMC檢測(cè)方法與其他檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比，優(yōu)勢(shì)在于；一管法的反應(yīng)，不需要其他條件限制靈敏度較高，達(dá)1cp/ul，反應(yīng)時(shí)間較短15-20min。

  整個(gè)文章講下來作者是做了大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并且做的結(jié)果也比較好，總結(jié)下來有以下幾點(diǎn)：1、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短，實(shí)際項(xiàng)目測(cè)試了人巨細(xì)胞病毒、新冠病毒，靈敏度與QPCR相當(dāng)、檢測(cè)時(shí)間在10-15min。

  作者也著重驗(yàn)證了我們?cè)噭┡ccas蛋白的兼容性更好。

  第二篇文章是《MIRA結(jié)合cas13a雙重膠體金試紙條檢測(cè)》，希望能給我們后續(xù)的研究帶來一些啟發(fā)。

實(shí)驗(yàn)流程：核酸提取 → MIRA基礎(chǔ)擴(kuò)增富集底物 → T7轉(zhuǎn)錄酶將雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA，cas13a-crRNA復(fù)合體識(shí)別并激活切割活性 → 切割報(bào)告探針（熒光檢測(cè)/試紙條檢測(cè)）

檢測(cè)體系的優(yōu)化，除了之前一直強(qiáng)調(diào)的MIRA前端恒溫?cái)U(kuò)增引物篩選之外，CRISPR體系也有一些優(yōu)化，首先需要篩選crRNA，從結(jié)果可以看到不同crRNA序列對(duì)檢測(cè)也會(huì)有一定影響。此處選擇新冠N基因，N-8作為最優(yōu)crRNA。

CRISPR熒光檢測(cè)方法條件優(yōu)化

  • 探針選擇：probe1

  • MgCl 2的終濃度：20uM

  • T7 RNA聚合酶：1.5U/uL

  • RNase抑制劑：0.8U/uL

  • 牛磺酸：10uM

  • MIRA引物濃度：5uM

作者雙重膠體金試紙條的檢測(cè)原理是我們比較關(guān)注的地方，同時(shí)也可能會(huì)跟我們提供一些新的思路：

    T線檢測(cè)N基因，C2線作為檢測(cè)內(nèi)參的質(zhì)控線，

  這里N基因由MIRA擴(kuò)增后被cas13a識(shí)別并切割，T線檢測(cè)，靈敏度高；

  內(nèi)參基因由MIRA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶地高辛、TAMRA，由C2線檢測(cè)；

  引入內(nèi)參的意義在于，保證樣本有效性，防止假陰。

雙重試紙條結(jié)果顯示，靈敏度在0.25cp/UL，且無交叉反應(yīng)，特異性較好。

  同時(shí)也做了熒光型檢測(cè)，靈敏度也在0.25cp/UL，且無交叉反應(yīng)，特異性較好。

  最終文章研究意義在于：靈敏度較高、可以做早篩判定、確保樣本的有效性，同時(shí)此免疫層析的方法，不需要配合儀器使用，降低成本，在簡(jiǎn)單的環(huán)境下就能進(jìn)行。

安普未來生物團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)十多年的技術(shù)沉淀，開發(fā)出代表未來生物檢測(cè)技術(shù)趨勢(shì)的多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification）。并以MIRA為核心平臺(tái)技術(shù)研發(fā)出“超快速核酸釋放技術(shù)”、“雙通道恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀”、“一體化全自動(dòng)封閉檢測(cè)系統(tǒng)”、“自測(cè)型核酸檢測(cè)裝置”等一系列配套產(chǎn)品，并計(jì)劃啟動(dòng)“微流控芯片技術(shù)”“小型自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)”等多方面的新型產(chǎn)品，力求打造出快速分子檢測(cè)領(lǐng)域的整體解決方案，將MIRA技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便、污染風(fēng)險(xiǎn)小、現(xiàn)場(chǎng)作業(yè)等特點(diǎn)充分體現(xiàn)出來。