【檢測(cè)原理】本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下（一般為 39 ºC~42 ºC），反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA 結(jié)合蛋白和DNA聚合酶等利用特異性引物進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)。隨著擴(kuò)增產(chǎn)物積累，設(shè)計(jì)的特異性分子探針在核酸外切酶的作用下釋放熒光信號(hào)，使用熒光檢測(cè)設(shè)備能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。

【主要組成成分】

組成	含量	主要成分
E buffer	1.0ml*2管	反應(yīng)緩沖液
B buffer	0.15ml*1管	Mg2+等
正對(duì)照模板（089）	0.1ml*1管	合成質(zhì)粒
試劑	48份	酶、dNTPs 等

【儲(chǔ)存條件及有效期】

1. 儲(chǔ)存條件：溫度 ≤ -20 °C 恒溫環(huán)境，避光保存，避免重壓；

2. 產(chǎn)品有效期：14 個(gè)月；

3. 生產(chǎn)日期見外包裝

【適用儀器】

1. 適用于 Applied Biosystems 7500、QuantStudio 3/5 、 QuantStudio 6/7 Flex等熒光定量 PCR 儀；

2. 適用于我司的 WL-16-III 等恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀。

【樣本要求】

1. 按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采集樣本；

2. 樣本采集后建議盡快檢測(cè)，24 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)樣本可暫時(shí)保存于 4 ºC；長(zhǎng)時(shí)間保存則置于-70℃以下，并避免反復(fù)凍融；

3. 如使用樣本保存液或快速釋放劑等處理樣本，注意影響蛋白活性的物質(zhì)如酸、堿鹽、表面活性劑等殘留對(duì)試劑性能的影響。

【檢測(cè)方法】

1.試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

1.1 取出包裝盒中的各組分(凍干試劑除外)，室溫放置，融化后混勻，瞬時(shí)離心備用（注意，如未完全融化直接使用可能對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；

1.2 根據(jù)待測(cè)樣本、陰性和陽(yáng)性對(duì)照的數(shù)量準(zhǔn)備凍干試劑，每個(gè)凍干試劑加入 37.5 μL E buffer。

2.樣本處理（樣本處理區(qū)）

2.1 核酸提�。哼x擇合適的核酸提取方法和試劑提取樣本核酸；

2.2 向反應(yīng)管中加入 10 μL 核酸模板（模板量可調(diào)整，以無(wú)菌水補(bǔ)足；即核酸模板加無(wú)菌水共 10 μL），陽(yáng)性對(duì)照加入 10 μL 正對(duì)照模板，陰性對(duì)照加入 10 μL 無(wú)菌水；

2.3 每個(gè)反應(yīng)管加入 2.5 μL B buffer, 蓋好管蓋（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將 B buffer 加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)）；上下顛倒反應(yīng)管 8-10次充分混合，混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。

3.核酸擴(kuò)增（擴(kuò)增區(qū)）

根據(jù)不同的應(yīng)用需求可以選擇不同的程序

設(shè)置方式：

1）程序設(shè)置方案一（推薦）：靈敏度高，適用于低濃度樣本檢測(cè)，但擴(kuò)增曲線可能出現(xiàn)非典型 S 形態(tài)，不同濃度樣本結(jié)果 Ct 無(wú)明顯規(guī)律；

程序設(shè)置方案一結(jié)果示例

2）程序設(shè)置方案二：操作簡(jiǎn)便，低拷貝樣本檢出率低于程序設(shè)置方案一。

程序設(shè)置方案二結(jié)果示例

*注：結(jié)果示例僅用于說(shuō)明兩種程序下熒光曲線差異，實(shí)際結(jié)果以實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)。

3.1 程序設(shè)置方案一

3.1.1 程序設(shè)置

步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
1.恒溫孵育	39ºC-42ºC	4 min	/
2.熒光檢測(cè)	39ºC-42ºC	30 s	30

注：

i 溫度設(shè)置推薦 39℃；

ii. 步驟

①為孵育階段，在恒溫金屬浴進(jìn)行；孵育結(jié)束后上下顛倒反應(yīng)管 8-10 次充分混勻后瞬離，再進(jìn)入步驟②；

iii. 步驟

②為熒光檢測(cè)階段，檢測(cè)通道為 FAM，30s/cycle，30 個(gè)循環(huán)，時(shí)長(zhǎng) 15 分鐘；

iiii.使用 ABI 系列熒光定量 PCR 儀，請(qǐng)務(wù)必于

Passive Reference 和 Quencher 處均選擇“None”;

3.1.2 質(zhì)量控制

陰性對(duì)照 Ct 值 ≥27 或未檢出，陽(yáng)性對(duì)照Ct 值 ≤ 15；同一實(shí)驗(yàn)需同時(shí)滿足以上要求，否則本次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

3.1.3 結(jié)果判讀

根據(jù)分析后熒光曲線圖像調(diào)整檢測(cè)通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設(shè)為 1~2 循環(huán)、終止設(shè)在本組數(shù)據(jù)中最小的 CT 值循環(huán)處（一般可設(shè)置為 2~4），使各項(xiàng)參數(shù)符合“3.1.2 質(zhì)量控制”中的要求，然后進(jìn)行陰陽(yáng)性判定：FAM 通道擴(kuò)增曲線呈指數(shù)增長(zhǎng)且 Ct<27 為陽(yáng)性；FAM 通道擴(kuò)

增曲線無(wú) Ct 值或 Ct≥27 為陰性

3.2 程序設(shè)置方案二

3.2.1 程序設(shè)置

39℃，F(xiàn)AM 通道 30 秒采集一次熒光信號(hào)，設(shè)置 40 個(gè)循環(huán)。

3.2.2 質(zhì)量控制

陰性對(duì)照 Ct 值≥35 或未檢出；陽(yáng)性對(duì)照 Ct值≤ 20；同一實(shí)驗(yàn)需同時(shí)滿足以上要求，否則本次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

3.2.3 結(jié)果判讀

根據(jù)分析后熒光曲線圖像調(diào)整檢測(cè)通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設(shè)為 1~2 循環(huán)、終止設(shè)在本組數(shù)據(jù)中最小的 CT 值循環(huán)處（一般可設(shè)置為 2~6），使各項(xiàng)參數(shù)符合“3.2.2 質(zhì)量控制”中的要求，然后進(jìn)行陰陽(yáng)性判定：FAM 通道擴(kuò)增曲線呈指數(shù)增長(zhǎng)且 Ct<35 為陽(yáng)性；FAM 通道擴(kuò)

增曲線無(wú) Ct 值或 Ct≥35 為陰性。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

1. 樣本采集、運(yùn)輸、保存不當(dāng)，試劑運(yùn)輸、保存、配制不當(dāng)都可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至?xí)䦟?dǎo)致假陰性結(jié)果；

2. 如果實(shí)驗(yàn)室污染、試劑污染、樣品交叉污染，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

3. 因方法學(xué)差異，使用市面上部分品牌的熒光 PCR 儀可能出現(xiàn)熒光曲線異�，F(xiàn)象，推薦使用我司設(shè) 備或 AppliedBiosystems 系列熒光定量 PCR 儀。

【注意事項(xiàng)】

1. 使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書，嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作；

2. 樣品處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)穿著工作服，戴一次性手套，實(shí)驗(yàn)分區(qū)域進(jìn)行避免交叉污染；

3. 使用有效期內(nèi)試劑，且各組分不得與其他批號(hào)混用，試劑盒各組分使用前室溫充分融化后混勻，短暫離心后使用；

4. 反應(yīng)管中盡量避免氣泡存在，管蓋蓋緊，反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增管置于密封袋內(nèi)，按要求丟棄處理；

5. 本試劑盒僅用于科研使用，不作為臨床診斷使用。

商品參數(shù)